引物的合成原理

Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期，目前引物合成基本采用的是固相亚磷酰胺三酯法。目前国内主要的引物合成公司包括英骏、上海生工、南京金斯瑞、深圳华大基因、大连宝生物以及上海赛百盛，当然还有无数小的引物合成公司。各引物合成公司有很多，使用的DNA合成仪也有很多种，但无论采用什么机器合成，合成的原理都相同的。不同合成仪的主要差别体现在合成产率的高低，以及试剂消耗量和单个循环用时的差别。

引物合成通常是将DNA3'端的第一个碱基结合在固相载体CPG (Controlled Pore Glass)上，然后按从3'→5'的方向进行DNA合成，相邻的核苷酸间通过3'→5'磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：

1. 第一步：通过与三氯乙酸反应，脱掉附着在固相载体CPG上的第一个碱基5' -OH基团上的保护基 (DMTr)，得到游离的5'-羟基，准备附加下一个新的碱基；

2. 第二步：活化新的碱基单体 (Phosphoramidite)，过程包括将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，生成一个3'端被活化，5'-OH被DMTr保护的活性中间体。

3. 第三步：步骤二中制备的新的3'端活化的碱基，与第一个碱基游离的5'-羟基发生缩合反应；

4. 第四步：用乙酸酐和1-甲基咪唑将没有反应的第一个碱基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再进一步参与反应，这种短片段可以在纯化时分离掉；

5. 第五步：在氧化剂碘的作用下，将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯 (即将三价磷氧化成五价磷)。

6. 经过上述一个循环过程，一个新的脱氧核苷酸至此被连接到固相载体的核苷酸上，因此重复进行第一步到第五步的循环过程，即可完成所需的DNA序列。在合成过程中，可以观察TCA处理阶段的颜色以判定合成的效率。

7. 合成结束后，通过氨水高温处理，将合成的DNA分子从CPG上切下来，再进行进一步的纯化。

由上述DNA的化学合成原理可知，DNA的化学合成是从3' 端开始，经一系列的化学反应，逐个地将碱基连接起来的。但过程的每一步反应效率都不可能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。其中，偶联反应的效率最高可达到99%，也就是说，每附加一个新的碱基，都会有至少占总量1%的DNA片段附加不上新的碱基 (出现合成失败DNA片段)，而这些合成失败的DNA片段全部残留在合成DNA粗制品中。如果使用此粗制品直接进行实验，很多实验的结果会受到影响。

一般，粗制品中的目的DNA序列和失败DNA序列的比例大致如下表：

上表中的数据仅是假设每次偶联反应的效率为99%时计算出的近似值，如果进一步考虑其他因素，则上表中的失败DNA的比例还会进一步增大。因此，对合成DNA粗制品进行必要的纯化是非常重要的。具体相关内容可以参见前面介绍的各种引物纯化方式的选择，含原理及效果简介。