Annexin V-细胞凋亡检测方法

Annexin V凋亡检测原理：

当细胞发生凋亡时，会首先出现细胞膜结构的改变。其中在正常情况下，细胞膜中磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）通常存在于内表面，而在细胞发生凋亡的过程中，PS会外翻、转移到质膜的外层。因此可以通过该现象，利用检测磷脂酰丝氨酸的方法，检验细胞是否发生凋亡。

Annexin V是膜联蛋白的一种，其功能目前尚不明确，但Annexin V已知可在钙离子存在的情况下与磷脂酰丝氨酸高亲和力结合。利用该特点，使用荧光或其他偶联标记标记的Annexin V即可检测细胞膜表面暴露的PS。

由于细胞在晚期凋亡或死亡后细胞膜结构破坏，此时Annexin V可以随意进出细胞，染色呈阳性，这就造成与我们关注的早期凋亡事件无法区分。而在细胞早期凋亡时，细胞膜完整性尚未破坏，此时非浸透性荧光染料如7-AAD或PI无法进入细胞，染色呈阴性。因此结合Annexin V和7-AAD/PI染色，经流式细胞仪和荧光显微镜检测，即可区分早期凋亡和晚期凋亡/死亡细胞。

Annexin V凋亡检测方法：

1. 药物处理诱导凋亡。
2. 胰酶消化细胞：由于EDTA会螯合钙离子，因此使用不含EDTA的胰酶。
3. 取1-5×10⁵细胞离心去上清，含血清的培养基洗1次。
4. 用500ul Binding buffer（或用PBS）重悬细胞。
5. 加入5ul Annexin V 和5ul PI（或7AAD），室温避光孵育5分钟。
6. 流式细胞仪检测或荧光显微镜观察。
7. 根据荧光的发射和接受波长，一般常用Annexin V（FITC）- PI 和Annexin V（APC）- 7AAD的组合。

Annexin V凋亡检测分析：

以下显示一张典型的流式细胞仪检测得到的细胞凋亡图。图中Annexin V阳性而PI（或7AAD）阴性的细胞为凋亡早期细胞，Annexin V和PI（或7AAD）双阳性的细胞为凋亡晚期或坏死细胞。
注：分析上面的原理可知不应出现Annexin V阴性而PI（或7AAD）阳性的细胞（也即下图右下角的一群），出现此情况的最常见原因是Annexin V用量不足。