原代细胞传代方法-源自ATCC

对于原代细胞或其他对“过度消化”很敏感细胞的传代，通常需要使用低于常规浓度的胰酶/EDTA消化液。ATCC作为世界细胞的集散中心，对于细胞培养很有话语权，这里援引了ATCC一份Protocol中提到的处理原代培养细胞的传代方法，希望对大家有帮助。

这里使用的胰酶/EDTA消化液具体为：

组分：0.05% 胰酶，0.02% EDTA溶于不含钙镁的PBS。

存储条件：-20°C存储，避免反复冻融

pH：7.6 ± 0.4

传代的一般步骤：

注意：每种细胞或细胞系对于胰酶/EDTA的敏感性不同。为了得到最佳的结果，在进行消化的同时需要不间断的观察细胞的解离情况以避免损伤细胞。

1. 将DPBS、胰酶/EDTA以及胰酶中和液预先放置于室温进行预热。将细胞培养使用的完全培养基预热至37°C。
2. 小心吸弃细胞的培养液，如果培养基中含有血清，请在加入胰酶/EDTA消化液前用DPBS清洗两次。
3. 以每25cm2培养面积对应1-2ml消化液的比例，在每个培养瓶中加入合适量的胰酶/EDTA（以T-25培养瓶为例，应使用1-2ml消化液）。
4. 轻轻上下倾斜培养瓶以保证消化液覆盖所有的细胞表面，然后将多余的液体吸除，但注意不要吸的太干。
5. 在显微镜下观察细胞。当细胞彼此间分开，细胞收缩变圆（通常在3-6min），轻轻敲击培养瓶数次以帮助细胞从培养瓶表面脱离。不要过度消化，以防损伤细胞。
   • 对于一些贴壁性很强的细胞，比如表皮细胞，可能需要延长消化时间并且可能需要在37°C进行消化。
   • 对于某些类型细胞，可能需要加大敲击培养瓶的力度以帮助细胞的脱壁。
6. 当大多数细胞已经脱离，迅速在培养瓶中加入等体积的胰酶中和液。轻轻吹吸或涡旋培养板以保证胰酶/EDTA被完全中和。
7. 转移细胞悬液至一个无菌的离线管中，放置在一边，继续处理培养瓶中剩余的细胞。
8. 加入3-5ml DPBS至培养瓶中以收集可能剩余的细胞。
9. 将细胞/DPBS悬液转移到前面收集的离心管中。
10. 重复第8和第9步，直至培养瓶中的所有细胞收集完全。
11. 150 x g离心3-5min。
    • 不要过度离心，以防损伤细胞。
    • 离心后，细胞应该形成一个清晰的疏松沉淀。
12. 吸弃上清，使用2-8ml新鲜预热的完全培养基重悬细胞。
13. 细胞计数，并以合适的密度接种到新的培养瓶中。
14. 将新接种的培养瓶放回37°C, 5% CO₂的培养箱，在进行进一步的处理前，至少孵育24-48h。（研小弟注：细胞传代后尽量不要经常去动它，有时候大家实验很着急或者刚开始学习养细胞，总是一天看好几次，但这样的导致的结果是细胞反而不好！）