动物细胞冻存及复苏方法-源自ATCC

细胞的冻存（存储于-130°C以下的低温中）是一项广泛应用于细胞长期保存的方法。除了提供宝贵的后备供应以外，合适的存储方法同时也会减少细胞的特性改变或丢失。这种“培养漂移”的现象源于大多数细胞系在培养过程中的老化和进化过程中会出现表型和基因型的改变，并会随时间累计。

成功的冻存过程依赖于下面四个关键方面：

1. 合适的处理和收集细胞
2. 合适的冻存液
3. 良好控制的冷冻速率
4. 低温存储

以下描述的方法是针对典型的生长于含胎牛血清培养液的哺乳动物单层贴壁细胞，经简单后可适用于多种不同的细胞类型。

1. 细胞的选择和检测

在进行冻存以前，需要保证细胞处于活跃生长的状态（对数或指数生长期）以保证细胞处于最健康的状态从而利于后面的复苏。最好在细胞收集24小时前对细胞进行换液。同时我们也推荐对细胞进行微生物污染检测，特别是支原体检测，并且使用适当的方法对细胞进行特性鉴定（物种和细胞类型）。

在倒置显微镜下观察细胞的大体形态，检查是否有微生物污染的迹象。同时我们也需要使用肉眼观察细胞培养液中是否存在漂浮的小的真菌，由于这些菌体通常漂浮在液面，因此我们在进行显微镜观察时通常不容易发现。如果在我们日常的培养过程中使用了抗生素，那么在冻存前的一到两周的时间最好使用不含抗生素的培养基培养，这样就很容易检测出细胞中是否存在隐匿的污染。

2. 细胞的收集

通常可参考您常规使用的标准细胞传代方法。在细胞的收集过程中应尽可能的轻柔，因为如果在此时细胞受到损伤，加上细胞在经历后续的冷冻和解冻过程中的进一步损害，可能会导致细胞在复苏后难以存活。以下推荐的试剂用量是针对75-cm²（T-75）的培养瓶而言，如果使用其他规格的培养容器需要进行相应的调整。

1. 使用一个无菌的吸管将培养液吸除。任何接触到细胞的材料和溶液都应该进行妥善的处理。
2. 使用5-10ml PBS洗涤一次，以去除残留的FBS。
3. 加入3-5ml 胰酶或其他合适的消化液至培养瓶中，37°C孵育。提前预热消化液可缩短消化的用时。
4. 每隔几分钟在倒置显微镜下检查细胞的消化过程。一旦细胞变圆，既可轻柔的敲击培养瓶使细胞从培养瓶的塑料表面脱落下来。加入5ml含血清的培养液中和胰酶。如有必要可能需要用力吹打以将残留在培养容器表面的细胞洗脱下来，同时将细胞团块吹打成单细胞悬液。去除或中和消化液对于保证冻存细胞复苏时的活力非常重要，如果消化液无法被直接灭活也没有关系，因为它将会在接下来的离心步骤中被除去。
5. 收集细胞悬液至15ml离心管中。取出一部分悬液放在一边留作细胞计数，其余细胞进行100g离心5min以得到疏松的细胞沉淀。离心的同时使用血细胞计数器进行细胞计数，并使用台盼兰检测细胞的活力。

3. 配制冻存液:

冻存液的使用原则是使细胞在冷冻过程中的损伤降到最低。多种化学试剂曾被用作防冻剂，包括聚烯吡酮(polyvinyl-pyrrolidone), 乙二醇(ethylene glycol)，甲醇(methanol)以及甲基乙酰胺(methyl acetamide)等。但最常使用的防冻剂仍然是二甲亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)和甘油(glycerol)。

DMSO作为防冻剂在冻存液中的比例常在5-10%之间，具体的最佳浓度依据细胞的不同会有差异。

警告：虽然没有直接毒性，DMSO是一种强效溶剂并且可以快速沁入接触的皮肤。因此，使用DMSO存在潜在风险。请尽量避免接触到DMSO，处理含DMSO的废物时也要非常小心。另外，同样由于其是一种强效溶剂，某些批次商业供应的DMSO可能污染某些毒性物质，因此不可用于细胞的冻存。

甘油在冻存液中的最终比例常在5-15%之间，和DMSO一样，最佳的浓度仍然取决于具体的细胞种类。

增加冻存液中的血清浓度将有助于提高一些难以保存细胞的活率，偶尔也会使用高达90-95%的血清（不添加培养液，只包含血清和抗冻剂），特别是对于一些敏感的杂交瘤细胞系。对于常规生长在无血清培养液中的细胞，在冻存液和复试培养液中添加50%的条件培养基（即无血清培养液经细胞培养24h后，收集的培养上清）可能会提过细胞复苏后的活力。此外，在无血清冻存液中添加10-20%的细胞培养级白蛋白也可能会提高冻存后细胞的存活率。

1. 弃除上清，将细胞重悬于足量的细胞冻存液中，保证最终每毫升冻存液中细胞数为2-5×10⁶。
2. 标记冻存管，要求至少标明细胞的名称和日期。然后在每个冻存管中加入1.0-1.8ml的细胞悬液并旋紧密封。

4. 细胞冻存：

缓慢且均匀的降温速率对于保证较好的细胞复苏效果非常重要，通常来说每分钟1到3°C的下降速率适用于大多数的动物细胞。控制细胞降温过程的最佳方案是使用程序电子降温仪（programmable electronic freezer unit）。但也有许多商业供应的机械降温仪，当放置于-70至-90°C深低温冰箱过夜时，这些降温仪也可以达到令人满意的且可重复的降温速率。

1. 按照生产商的说明，将标记的冻存管放置于合适的程序降温仪中。如果没有可用商业化降温仪，也可以手动自制一个，即将冻存管放入一个小的聚苯乙烯泡沫或绝缘纸板盒中，然后放入-70至-90°C深低温冰箱过夜。虽然这种方法适用于多种细胞系，但其并不能提供一个可控、匀速或可重复的降温过程，因此我们不推荐使用该方法冻存一些贵重的或稀有的细胞。
2. 无论使用何种降温方法，我们都应该将冻存的细胞快速高效的转移至最终的存储地点。如果无法保证及时转移，可以将冻存管暂时保存于干冰中，以防止在转移过程中因疏忽导致的临时升温。转移过程中的升温是导致复苏后细胞活力变差的一个主要因素。

5. 冷冻存储：

为了保证最佳的活率，应始终将细胞存储于–130°C以下的低温中。虽然在更高的温度下，细胞也可能存活，但细胞活率会随时间的推移逐渐降低。

液氮罐是理想的存储设备，细胞既可以浸没于液氮中也可以位于液氮上方的汽相中。为了安全考虑（以下第6点内容），我们更推荐进行汽相存储。

对于维护一个基于液氮的细胞库来说，有几点是需要特别注意的：

1. 确保标记系统适用于（永久）深冷储存。
2. 保持良好的记录，包括细胞存储的位置以及细胞的特性、增殖以及需要进行的处理等一套完整记录。请记住，细胞的储存时间很可能比冻存它们的人还要久远。
3. 准备好应急预案！液氮存储也可能出现差错。因此应该指派专人负责经常检查（最好是每天或至少为一周）液氮罐的状态。也可使用一些商业化的报警系统用于不间断的监测液氮罐的工作状态。对于非常重要或无可替代的细胞，应该分别存储于至少两个不同的地点。

6. 细胞的复苏：

对于浸没在液氮中细胞，在复苏时需要特别留意，如果在存储过程中冻存管出现泄露，液氮会缓慢的进入其中；这样在解冻的过程中，液氮的挥发可能会导致冻存管爆炸或将冻存管盖掀起，引起碎片飞溅非常危险。

安全防护：在从液氮中取冻存管以及解冻的过程中，要始终穿戴防护服、手套以及面罩。

1. 将冻存管置于37°C水浴中，轻轻摇动。为了减少污染的可能性，冻存管的O-圈以及盖子应该保持在水面以上。应该快速解冻（大约2min）。一旦内容物已经融化，请立即将冻存管从水浴箱中取出，然后用70%的乙醇进行擦拭或喷洒除菌。从这以后，所有的操作应在无菌的条件下进行。
2. 将冻存管中的内容物转移至一个25-cm²的培养瓶或100mm的Dish中，然后加入完全培养基进行稀释（培养瓶大约需要4-5ml，Dish约需10ml）。对于多数细胞系而言，不需要立即去除冻存液，通常可在复苏后8-24小时换液进行去除（但对于一些对冻存液敏感的细胞，我们就需要先进行细胞离心以除去冻存液）。然后置于37°C孵育培养。在复苏过程中应避免使用过度碱性的培养液（研小弟注：通常我们的培养液中都含有酚红作为pH指示剂，因此这里既尽量不要使用因偏碱而变紫的培养液）。建议事先将培养容器中加入培养液，置于培养箱中孵育不少于15min，以使培养液达到其正常的pH值，然后再加入冻存的细胞。某些细胞系在解冻后，当过于快速的加入大量新鲜培养基时可能会出现渗透压休克。此时应使用20°C-37°C下多次、少量、逐步增加（每次1-2ml）新鲜培养液的方法，每隔10-20min添加一次新鲜培养液。