贴壁细胞传代方法指南-源自ATCC

多数细胞系和原代细胞都会以一种单层的形式生长（单层细胞）或者覆盖在玻璃或经处理的塑料物体表面。为了保持细胞的健康与活跃增殖，通常需要对细胞进行有规律的传代。

最常见的传代方法是使用蛋白酶如胰酶或胶原酶破坏细胞间以及细胞与培养介质间的连接。当细胞被解离成单细胞悬液时，再将它们稀释并分发至新的培养容器中。在那里，细胞可以重新贴壁生长和分裂，然后经过一段时间培养，细胞又再一次长满（接近汇合）。此时，细胞又需要进行传代或用于下游实验。

以下指南描述了典型单层细胞的常规传代与维持的基本原则。为了得到一致的结果，坚持良好的培养记录非常重要，记录应包括细胞传代的日期和传代的次数。

细胞的检查：

应该养成良好的习惯对细胞进行常规的和认真的检查，以了解它们的状态和健康情况。

首先，用肉眼检查培养容器中是否存在可见的微生物污染，比如培养基pH改变、浑浊或有颗粒样的物体。同时也要注意观察有没有小的真菌菌落，因为它们在显微镜下不易被发现。这些菌落可能会飘浮在液体表面，特别是在培养容器周边附近。

其次，在倒置显微镜下观察细胞常规形态和生长状态，留意检查任何镜下可见的微生物污染的迹象。在某些细胞系中，培养液中漂浮的细胞通常是死亡的细胞。但是，许多细胞在进行有丝分裂的时候也会变圆，形成折光性很强（很亮）的球体，并且在受到扰动后也会飘浮起来。两者的区别在于，死细胞通常会变圆脱落但一般折光性不会很强。

除了这些日常检查外，还需要对细胞进行周期性的真菌、细菌以及支原体检查。

培养液的准备：

准备针对特定细胞系在购买或文献中推荐使用的新鲜培养液，并用记号笔在培养容器上标记传代时间和细胞代数等信息。确保添加了补充成分（如：谷氨酰胺、生长因子、抗生素等）并且预先放置培养箱进行了pH平衡。一个75-cm²的培养瓶大约需要12-15ml培养液，如何使用其他规格的培养容器需要进行相应的调整。

收集细胞：

大多数的细胞在完全生长汇合前（还有一些生长的空间）进行细胞传代，可以达到最佳的生长状态，因为此时细胞在处在活跃的对数生长期。实验中观察到的任何异常现象都应该被记录在每个细胞系特定的记录本上。

细胞的最佳收集方法的制定原则是以最轻柔的方式破坏细胞与培养容器以及细胞之间的连接。对于大多数细胞而言，这就需要使用含化学试剂或酶的消化液。胰酶是最常用的消化液，它的常规用量在0.05%到0.25%之间。胰酶的最佳工作浓度通常是指可在较短时间内（10-15min），使细胞从培养容器壁上脱落形成单细胞悬液的最低浓度。某些细胞相对其他的细胞更难以消化，此时通常在胰酶中还需要添加胶原酶或螯合剂如EDTA等，以提升消化能力。

当细胞生长在含哺乳动物源性血清的培养液时，细胞需要首先进行清洗以除去血清，因为血清的存在会抑制胰酶的活性。血清残留是胰酶消化失败的常见原因。细胞消化时，要求使用不含钙和镁离子的缓冲液，因为这两种离子在细胞间以及细胞与培养容器间的吸附中发挥重要作用。

单层细胞的收集：

1. 去除细胞培养液

2. 加入5ml消化液清洗细胞一次，然后吸除（该方法的试剂用量是针对75-cm²培养瓶，如果使用其他培养容器需要适当的增加或减少试剂的用量）。如果消化液中包含胰酶，就需要清除所有的血清残留，因为血清中含有胰酶抑制剂。（研小弟注：这里也可以使用DPBS清洗1-2次，节约点消化液）

3. 加入2-3ml消化液，每隔5min在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。对于特别难以消化的细胞，可以在37°C进行消化。对消化液进行预热可以减少消化时间，为了避免细胞成团，在等待细胞脱落的过程中不要敲击或摇晃培养瓶。

4. 使用移液管向细胞悬液中加入6-8ml生长培养液，吹打培养瓶底部收集所有残留的细胞。此时，在倒置显微镜下进行简单观察应该看到细胞悬液中至少95%的细胞为单细胞。如果不是，可能需要进一步进行吹打。

5. 收集细胞悬液，按需求进行细胞计数或者等分，然后分发至准备好的培养容器中。对于一些细胞系或者酶消化液（胶原酶），在分发之前有必要通过轻柔的离心（125g，5min）去除酶消化液。

细胞的计数或等分：

为了得到细胞的生长速率或者按已知的浓度接种细胞，就需要对细胞悬液进行计数，我们可以使用血细胞计数器或电子细胞计数器。血细胞计数器的优点是比较便宜，而且可以同时检测细胞的活率。轻轻混匀细胞悬液，取出0.5ml进行细胞计数。向其中加入0.5ml活细胞染色液如台盼兰（trypan blue）或赤藓红B（erythrosin B），充分混匀，取出部分样品，小心加入干净的血细胞计数器中。

计算细胞悬液中细胞的实际浓度（每毫升悬液中的细胞数）以及细胞的活率，然后计算为了达到合适的传代密度需要使用的悬液体积。除了细胞计数，细胞悬液也经常按传代培养瓶的数量进行等分。例如，1：2传代意味着将一个培养瓶中得到的细胞悬液等分至两个新的等培养面积的培养瓶中，该法适用于细胞的精确密度不是非常重要时的常规细胞传代。

细胞的接种：

分发合适的细胞悬液至事先准备好的细胞培养瓶中（将高浓度的细胞悬液直接加入空的培养瓶会导致细胞的不均匀贴壁和生长）。对于生长快速的细胞，接种的密度可以低一些。然而，有些细胞在低于一定接着密度时，生长的不好。但多数细胞在起始密度为10³-10⁴细胞每平方厘米或更高（每个75-cm²培养瓶接种7.5×10⁴到7.5×10⁵个细胞）时都可以生长的很好。

细胞的培养：

将细胞放回培养箱，大多数的哺乳动物细胞在35°C到37°C的恒温下生长的最好。除了维持稳定的温度，对于非封闭的培养容器如Dish或多孔板，培养箱还需要维持较高的湿度和CO₂水平。高湿度可以防止培养容器中的液体挥发损失，进而导致的培养液浓缩引起的高渗透压。

当培养液使用的是含适量的NaHCO₃的缓冲系统时，提升CO₂的水平（通常为5%-10%）可以使培养液维持在一个和适的pH范围（7.0-7.6）。为了使此类缓冲系统可以正常的工作，需要使用非密封（瓶盖旋松）或气体可透过的培养瓶以保证正常的气体交换。如果没有可用的CO₂，有一种缓冲系统可以在封闭的培养容器中维持培养液处在合适的pH范围。

传代次日进行镜下观察，确保细胞已经重新贴壁并活跃增殖。培养期间按要求进行换液，对于大多数活跃增殖的细胞来说，通常一周需要换液2-3次。