红色荧光蛋白介绍

荧光蛋白开发的主要目标已经变成构建红色荧光衍生物，使它的特性相当于或者超过绿色荧光蛋白。在诸多的红色荧光蛋白的优点中，最突出的是它可以跟现在的共聚焦显微镜和宽视场显微镜兼容（和它们的滤光片配置），还有就是可以对整个动物成像，使动物在红光下更透明。因为以Aequorea victoria水母的绿色荧光蛋白为基础构建红色转化突变体的成功率已经远高于构建黄色转化突变体，因此研究人员的研究方向转移到这种热带珊瑚上来。

第一个广泛应用的荧光蛋白是从Discosoma striata中分离得到的，通常被叫做DsRed。一旦成熟，DsRed的荧光发射光谱峰值为583nm而激发光谱主要峰值为558nm，其他次要峰值在500nm附近。然而，DsRed也有一些问题存在。当荧光发射在绿光区域时，DsRed的成熟缓慢，需要一段时间。说到绿色状态，这一问题在与其他绿色荧光蛋白一起在多标记实验中会遇到很多问题，因为光谱重叠了。此外，DsRed易于形成四聚体，也可以形成大的蛋白在活细胞中聚集。虽然这些缺点在DsRed作为报告基因应用时并不重要，但是作为表位标签应用时就受到了很大的限制。与绿色荧光蛋白相比，DsRed结合物不像绿色荧光蛋白那样成功而且毒性更大。

DsRed荧光蛋白应用的一小部分问题已经通过突变技术得到了克服。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已经进行了一些突变改造，这样就可以组织蛋白凝集和降低了毒性。除此之外，通过这些修饰，荧光基团的成熟时间也变短。DsRed2蛋白还是会形成四聚体，但是由于它成熟加快，所以在多色荧光标记实验中可以更好的跟绿色荧光蛋白结合使用。在第三代DsRed的突变体中，成熟时间更短，荧光强度也增强。DsRed-Express的红色荧光发射光在表达后一个小时就可以观察到，而DsRed2要在表达后6个小时观察，DsRed则需要11个小时。一个叫做RedStar的酵母中使用的变种，成熟率和亮度均有增加。DsRed-Express和RedStar两个变种中绿色状态并不明显，这一特性使得这两种荧光蛋白成为多色标记实验中的橙色-红色区域最好的选择。因为这些探针还是倾向于形成四聚体，所以他们不是标记蛋白质的最好选择。

另外有一些很有希望应用的红色荧光蛋白已经从珊瑚组织中分离出来。第一个适合哺乳动物的是从紫点海葵Heteractis crispa分离出来的HcRed1，已经商业化应用。HcRed1最初来自于一个通过突变改造可以吸收红光的非荧光生色蛋白，改造后可以产生微弱的荧光二聚体，最大吸收值在588nm，最大发射光为618nm。虽然这个蛋白的荧光发射谱可以与DsRed分开，但是它易于跟DsRed共凝集，亮度也不够。将两个分子纵列起来改造HcRed原则上可以克服二聚化，但是两个分子配对更易于产生单体标签。因为这两个蛋白的光亮度仍然没有提高，所以在常规活细胞观察中并不是一个很好的选择。

荧光蛋白最有意思的开发之一就是这些探针作为分子或光学记号笔使用，它们在内部光子激发或者时间流逝时颜色改变或者发射光强度变化。举例来说，在原始的水母多肽序列的单点突变就产生了一个具有光活性的绿色荧光蛋白（PA-GFP），经过400nm范围的光照射后，它的激发峰值从紫外光变为蓝光。没有转变的PA-GFP的激发光峰值与野生型蛋白的相似（大约395-400nm）。光转化之后，激发光峰值在488nm，大约增加了100倍。PA-GFP的转化和未转化形式之间差异非常大，这样的变化在追踪细胞内分子的亚群动态过程非常有用。图6是一个含有PA-GFP转染的哺乳动物活细胞，首先用488nm氩离子激光照射后转化为405nm的蓝二极管激光照射。